?中瑞祥解析活性氧在線分析儀操作步驟注意事項

主要通過熒光探針檢測原理工作，利用DCFH-DA等探針與細胞內活性氧（ROS）反應生成熒光物質，通過熒光強度定量ROS水平?。以下是具體原理和操作步驟：

檢測原理

?熒光探針法?：DCFH-DA探針無熒光，可穿透細胞膜，在細胞內被酯酶轉化為DCFH。DCFH被ROS氧化后生成強熒光的DCF，熒光強度與ROS濃度成正比。 ?

?其他方法?：還包括化學發光法、電子順磁共振（EPR）等，但熒光法因靈敏度高、操作簡便應用。 ?

操作步驟

?細胞準備?

貼壁細胞：檢測前1天鋪板，密度<5×10?/mL。

懸浮細胞：收集后調整密度至1.0×10?-2.0×10?。 ?

?藥物誘導（可選）?

用無血清培養基稀釋藥物處理細胞，孵育時間因藥物和細胞類型而異（如HeLa細胞需30-60分鐘）。 ?

?陽性對照（可選）?

用Rosup（100 μM）處理細胞，提高ROS水平，驗證檢測效果。 ?

?探針裝載?

DCFH-DA稀釋至10 μM，避光孵育30分鐘。

洗滌去除未進入細胞的探針。 ?

?檢測方法?

?熒光顯微鏡?：FITC濾光片觀察熒光，懸浮細胞需滴加至載玻片。 ?

?流式細胞儀?：488 nm激發，530 nm發射，分選ROS陰性/陽性細胞。 ?

注意事項

避光操作：DCFH-DA對光敏感，需全程避光。

細胞狀態：確保檢測時細胞活性良好，避免非特異性熒光干擾